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巨细胞病毒感染巨细胞病毒感染是由巨细胞病毒(cmv)引起的性传播疾病。巨细胞病毒为DNA病毒。特征性病变为感染细胞增大,细胞核和细胞质内分别出现嗜酸性和嗜碱性包涵体。CMV感染在全世界分布,人是CMV的唯一宿主。不同国家及不同经济状况感染率不同。成人CMV感染和免疫功能有密切关系。病原体  巨细胞病毒属疱疹病毒群,具有典型的疱疹病毒样结构,是一种大DNA病毒,直径为80-110纳米,病毒壳体为20面对称体,含有162个壳粒。周围有单层或双层的类脂蛋白套膜。它有1个血清型,可分3个以上亚型。它只能在活细胞中生长,一般用人的纤维母细胞培养。它在体外生长缓慢,复制周期为36-48小时。被巨细胞病毒感染的细胞在光学显微镜下检查可见到细胞和核变大,有包涵体形成。核内包涵体周围与核膜间有一轮晕,因而称为猫头鹰眼细胞,这种细胞具有形态学诊断意义。单靠临床表现不能诊断CMV感染,从临床标本中分离出病毒,同时抗体呈出4倍以上增加或持续抗体滴度升高,将有助于诊断。  一、病毒分离  最好用唾液、尿液、生殖道分泌物、乳汁和白细胞,接种到人的成纤维细胞内繁殖和分离,细胞病变效应(CPE)在1天或数周后出现,经固定和HE染色后可观察到巨细胞,核内有内包涵体,核周晕圈及嗜酸性胞浆内包涵体,很象猫头鹰眼(owl′seye)亦可用单克隆或多克隆抗体的荧光染色等方法检查。  二、血清抗体检测  最常用的有补体结合试验(CF)、间接免疫荧光试验(IIF)、免疫酶试验(EIA)、间接血凝试验(IHA)和放射免疫试验(RIA)等检测CMV-IgG和IgM抗体。当单份血清标本已确定既往有CMV感染时,应当立即留血清标本,以及间隔2周、4周、8周再留血清标本,结合病毒分离可作原发感染诊断。  三、DNA探针  已广泛应用于检测CMV,其中以32P标记的探针敏感性最高,对某些标本来说,杂交方法可能比病毒分离更敏感。  四、聚合酶链式反应(PCR)  (一)标本的采集及处理  采集的标本包括患者的血液、尿,以及腺体组织等。由全血制备的血沉棕黄层(buffycoats)可保存于-80℃;尿液标本可保存于液氮中。冻存标本应避免反复冻融。  尿液标本经2500r/min离心10min,以除去细胞碎片,收集上清液。由于尿液中含有PCR抑制剂,因此需用聚乙二醇(PEG6000)进行预处理:50μl尿上清与50μl20%PEG6000和25μl2mol/LNaCl混合,置冰浴中6h;15000r/min离心30min收集沉淀。再于6400r/min离心3min;尽可能吸去上清,将沉淀悬浮于蒸馏水中。该悬液可直接用于PCR扩增;扩增时应于100℃加热10min,迅速置冰浴中冷却。  (二)模板DNA的制备  1.由血液标本制备模板DNA  方法A:向血清中加入NaCl使最终浓度为150mmol/L;取10μl此血清于70℃处理45s后即可直接进行PCR扩增。  方法B:由血沉棕黄层(BCP)制备:①用PBS洗涤BCP两次,收取沉淀。②加入500μl6mol/L盐酸胍,匀浆。③加入30μl10mmol/LEDTA,10mmol/LNaCl,30μl20%Sarcosyl和5μl蛋白酶K(10mg/ml),混合均匀,60℃反应1h。④加入1130μl的乙醇,-20℃沉淀1~2h。⑤离心收集DNA沉淀。⑥用70%乙醇洗两次,最后将沉淀悬浮于少量10mmol/LTris-HCl,1mmol/LEDTA中。置4℃备用。  2.由冰冻组织标本制备模板DNA:①用恒冷切片机切取一块5~10μm冰冻组织块,置于1.5ml塑料管中。②加入10%用缓冲液配制的福马林。③10min后离心1~2min轻轻倾去上清液,沉淀用乙醇洗2次。④于室温干燥10~60min。⑤加入抽提缓冲液(100mmol/LTris-HCl,4mmol/LEDTA、pH8.0,400μg/ml蛋白酶K),使刚好浸没沉淀物(约50~100μl);将沉淀捣碎。福马林固定的或石蜡包埋组织经脱蜡和干燥后也可按此处理。⑥37℃放置过液。⑦置沸水中7min灭活蛋白酶K。⑧离心收集上清,取1~10μl即可进行PCR扩增。  3.由尿液标本制备模板DNA:①100μl尿上清液与100μl6mol/L异硫氰酸胍,7μl2mol/LNaCl和20μl玻璃粉悬液(DNAPREP,AsahiGlassCo,Tokyo)混合。②室温放置10min后,6400r/min离心2min,收集沉淀。③沉淀用50%乙醇,10mmo/LTris-HCl、pH7.4,50mmol/LNaCl洗一次,6400r/min离心1min。④同样洗涤沉淀2次,收集沉淀。⑤加入50μl蒸馏水,于55℃作用15min。⑥15000r/min离心2min,收集上清(含HCMVDNA),进行PCR扩增,将此悬液于100℃加热10min,并迅速于冰浴中冷却。  (三)引物及探针  引物及探针的设计是根据已发表的CMV的直接早期蛋白基因的启动子区和开始的4个外显子序列、晚期抗原gp64基因以及磷酸化蛋白pp71基因序列。常用的引物和探针列在表3中。  (四)PCR扩增步骤  1.10×反应缓冲液:100mmol/LTris-HCl、pH8.4,500mmol/LKCl,25mmol/LMgCl2,2mg/ml明胶。  TaqDNA聚合酶:5U/μl。  10×dNTP:4种dNTP各2.0mmol/L。  引物:100pmol/L。  2.常规PCR扩增  10×反应混合物(50μl)反应缓冲液5μl  10×dNTP5μl  模板DNA5μl  TaqDNA聚合酶0.2μl(IU)  引物各0.5μl  蒸馏水3.8μl  加1~2滴矿物油。  将反应混合物于94℃加热5min;然后于95℃30s,55℃40s,72℃60s,扩增35~40循环。  3.套式(nested)PCR扩增:①反应混合物的组成同(2),仅引物为IE2a和IE4b(包括了整个外显子3,共721b),各100pmol。于94℃60s,52℃150s,72℃480s,扩增20循环。②取2μl上述扩增产物,各加100pmol的引物IE3a和IE3b补加其他试剂。然后,于94℃60s,52℃150s,72℃180s,扩增20循环。  (五)产物鉴定  扩增产物的分析可采用固相(滤膜)杂交和液相杂交试验。  1.固相杂交:  ①预杂交液为3×SSPE,5×Denhardt,0.5%SDS和25%甲酰胺.含有扩增产物的滤膜于42℃预杂交30~60min。②加入标记探针(10cpm/μg,2ng/ml),杂交30~60min。③用0.2×SSPE,.01%SDS分别于室温洗涤滤膜3次,5min/次;于60℃洗一次,10min/次;再于室温洗一次以上,5min/次。④自显影。  2.液相杂交及电泳分析:  ①取1/10体积的扩增产物与0.5~1.0pmol末端记的探针混合。②加入最终浓度为150mmol/LNaCl,10mmol/L磷酸钠及1mmol/LEDTA溶液,使总体积为20μl。③95℃10min,然后于56℃60min。④离心10s加入样品缓冲液,于8%聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳。⑤电泳毕,用溴化乙锭染色,然后对X线片曝光,自显影。  HCMVDNA分子很大,其碱基序列尚未全部搞清。虽然它的DNA的限制性内切酶片段长度具多形性,但是对其基因组的离散性还不清楚。用单一引物对进行PCR扩增,可鉴定90%的HCMV野型分离株;而采用针对不同HCMV序列的两套以上的引物对,则可检测几乎所有的病毒株。因此,可根据情况使用两对或两对以上的位于基因组不同区域的引物进行PCR检测。  在HCMV模板DNA制备过程中,有时会产生一些小片段DNA,在PCR反应时常导致一定水平的本底产物,从而影响对结果的判定。在这种情况下可采用套式PCR法,其基本原理就是靶DNA的扩增分为两步:首先利用一对引物,扩增包括靶DNA在内的长片段DNA;然后取少量的扩增产物,利用只针对靶DNA的引物再进行第二次扩增。通过控制每步中的扩增循环数,即可防止由小片段DNA引起的假阳性。这种方法也可避免产生假阴性结果。  PCR检测HCMV标本具有很高的敏感性。从HCMV感染的组织培养上清可检测到相当于几十个病毒的DNA分子或1~5PFU病毒的DNA序列。用非放射性寡核苷酸探针进行Southern杂交分析扩增产物,可从尿液标本中检测到1pgHCMVDNA序列的水平;利用该系统,在4×104个细胞中只有一个病毒基因组即可检测出,较斑点印迹杂交提高2×103倍。  PCR技术对HCMV感染的检测具有临床应用价值,因为体液中病毒DNA先于病毒感染的临床症状或血清学证据的出现,可作为HCMV感染的早期指标。由于HCMV可通过胎盘内感染、产道感染等途径传播,而且受感染的新生儿死亡率较高,因此利用PCR进行早期诊断及采取及时的治疗措施,对优生优育也有重要意义。利用这种方法,还可鉴定器官或组织移植手术中供体是否为HCMV与许多严重病症的关系。再者,PCR检测指标稳定,还可进行半定量分析,因此可作为评价各种抗病毒药物疗效的手段。[全部]

巨细胞病毒感染

巨细胞病毒感染症状

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